Clinical Endocrinology (1976) 5, Suppl., 61s-72s

ON THE METABOLISM OF TWO ADRENOCORTICOTROPHIN ANALOGUES

JOHN R. J. BAKER, HUGH P. J. BENNETT, ANNE M. HUDSON, COLIN McMARTIN and GILLIAN E. PURDON

Horsham Research Centre, CIBA Laboratories, Horsham, West Sussex

SUMMARY

В данном исследовании сравнивается метаболизм и распределение препарата Synacthen (corticotrophin-(l-24) tetracosapeptide) меченного радиоактивным тритием и кортикотропина C-41795-Ba([D -Ser1, Lys17, Lys18]-corticotrophin-(l-18)-octadecapeptideamid), который вводились в/венно лабораторным крысам. С помощью препарата Synacthen и С-41795-Ва, меченных тритием мы смогли проследить за распределением в тканях двух этих пептидов. В работе показывается, что оба исследуемых вещества накапливаются почками. Причем почки способны накапливать как целые пептиды обоих исследуемых веществ, так и их фрагменты.

При патоморфологическом исследовании почек продемонстрировано накопление радиоактивного материала в лизосомальных структурах клеток находящихся в проксимальном канальце петли Генле.

Сравнивая распределение радиоактивных изотопов, которыми маркированы исследуемые пептиды было выяснено, что поглощение этих пептидов почкой происходит не везде, а только в определенных областях. Механизм поглощения выглядит следующим образом: в начале, внеклеточно, происходит быстрое расщепление пептидов на N - и C-концевые фрагменты. Затем эти крупные фрагменты, фильтруются через почечные клубочки и всасываются путем клеточного эндоцитоза, в проксимальном участке петли Генле.

Защита N- и С-концевых фрагментов молекул октадекапептидным остатком, препятствовала внеклеточному эндоцитозу, в связи с чем, концентрация незащищенных пептидов в почках была выше, чем тетракозапептида (tetracosapeptide). Следует учитывать, что уровень радиоактивного трития в почках также был выше, чем в других тканях, хотя концентрация исследуемого вещества относительно общего веса почечной ткани, была незначительна.

При помощи хроматографического анализа радиоактивности, нами было обнаружено, что уровень защищенных октадекапептидов (octadecapeptide) был выше, чем тканевой уровень исходных.

Мы считаем, что это свидетельствует о возможности депонирования исследуемых пептидов. Именно возможность депонирования, определяет устойчиво высокую концентрацию этих пептидов в крови и как следствие длительный биологический эффект, наблюдаемый при их введении.

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что в пептидные гормоны, как правило, имеют короткий период полураспада. Это связано с их инактивацией в плазме, а также с внутри- или внеклеточной деструкцией. В дальнейшем кровь разносит гормоны по различным тканям организма, в том числе и почкам, где происходит их клубочковая фильтрация.

Исследование метаболизма двух аналогов АКТГ - Synacthen (cortico - trophin-(l-24)-tetracosapeptide) и С-41795-Ва ([D-Ser1,Lys17,Lys18]corticotrophin- (l-18)-octadecapeptideamid) в кишечнике крыс показало, что оба исследуемых вещества подвержены воздействию кишечных эндопептидаз, в результате чего происходит их расщепление (Lowry & McMartin, 1974г). Внутривенная инфузия, исследуемых веществ крысам позволяет избежать их расщепления (McMartin and Peters, 1975г).

С помощью изолированных клеток надпочечников выделенных по методу Лоури с соавторами (Lowry et ai, 1973) нами была исследована биологическая активность исследуемых веществ. Выяснилось, что октапептиды имеют более высокую концентрацию в плазме, и имеют гораздо больший период полувыведения из плазмы крови, чем tetracosapeptide. Это объясняет данные полученные Майер et al. (1971), что биологические эффекты стероидов сохраняются гораздо дольше.

Мы считаем, что изучение метаболизма пептидных гормонов, помощью гомогенатов тканей - это не совсем точный метод. Так как, в процессе исследования, при подготовке препаратов изолированных клеток надпочечников, мы обнаружили, что поврежденные клетки также выделяют пептидазы (Bennett et al., 1974б).

Это возможное воздействия на биопробы минимизируются с помощью разбавления или очищенния клеточных суспензий, таким образом, чтобы избежать деградации тест пептидов в процессе анализа. Хотя трипсиноподобные (кислые) эндопептидазы ухудшают экспрессию синтетических аналогов АКТГ in vitro, нет оснований утверждать, что это играет существенную роль in vivo. Если бы это имело место, то невозможно было бы объяснить, почему N - и C-концевые фрагменты имеют такое заметное влияние на его жизнь in vivo.

В этом исследовании авторы пытаются обозначить более широкий подход к проблеме исследования пептидных веществ. В настоящей статье, обсуждается в основном те результаты, которые получены авторадиографией с распределением меченного тритием кортикотропина в исследуемых тканях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы
Все используемые химические вещества были надлежащего стандарта качества. Дистиллированная вода деионизировалась перед использованием. В качестве лабораторных животных использовались самцы крыс линии Вистар, полученые от Чарльза Реки (Великобритания) Лтд.", Margate, Кент.

Для того чтобы свести к минимуму потери пептидов в следствии их адсорбции на поверхности лабораторной посуды, использовалась пластиковая посуда, вместо стекла.

[3,5-3H2-Tyr2]-Corticotrophin-(l-24)-tetracosapeptide (29Ки/ммоль), [4-3H-Phe7]-corticotrophin-(l-24)-tetracosapeptide (24-7 Ci/ммоль), [3,5-3H2-Tyr23]-corticotrophin-(l-24)-tetracosapeptide (34-5 Ci/ммоль) и [D-Ser1,3,5-3H2-Tyr2,Lys17,18]-corticotrophin-(l-18)-octadecapeptideамид (17-05 Ci/ммоль) были синтезированы в лаборатории д-р D. E. Brundish и д-р. Уэйд.

Синтез [3,5-3H2-Tyr23]-corticotrophin-(l-24)-tetracosapeptide был проведен (Brundish и Уэйд, 1973). Все они имели полную биологическую активность. Synacthen эрекцию (corticotrophin-(l-24)-tetracosapeptide) и С-41795-Ва ([D -Ser1, Lys17, Lys18]-corticotrophin-(l-18)-octadecapeptideamid) были любезно предоставлен д-р W. Rittel и д-р B. Riniker, Ciba-Geigy Ltd, Базель, Швейцария.

Методы
Исследования проведены на изолированных клетках надпочечников по методу Лоури et al. (1973). Анализ экстрактов тканей и оценка степени деструкции меченых пептидов проводился с помощью ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе по методу Bennett et al., (1974б).

Подсчет радиоактивности

Радиоактивность была измерена на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Packard TriCarb модель 3003.